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一、大腸菌群定義和衛生學(xué)意義
大腸菌群定義：在一定培養條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學(xué)上分類(lèi)命名，它不代表某一種或某一屬的細菌，而是一組與糞便污染有關(guān)的細菌。這群細菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。
衛生學(xué)意義：大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的的程度。
二、GB4789.3-2016大腸菌群MPN法
1. 什么是MPN法？
?MPN法是統計學(xué)和微生物學(xué)結合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養后,根據其未生長(cháng)的最低稀釋度與生長(cháng)的最高稀釋度,應用統計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
?MPN值并不能表示實(shí)際菌落數， 實(shí)際菌落數有可能落在置信區間內的任何一點(diǎn)，MPN值是落在這個(gè)置信區間內概率最大的一點(diǎn)。
?靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。
2. 大腸菌群MPN計數的檢驗操作
3. 培養基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）
?月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(cháng)，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿(mǎn)足細菌生長(cháng)的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類(lèi)；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。
?36±1℃培養24h后若已產(chǎn)氣，則可停止培養。如果沒(méi)有觀(guān)察到有產(chǎn)氣的現象，則繼續培養至48±2h。
?如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯。
- +
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）
?膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(cháng)。
?培養基配方當中含有膽鹽，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會(huì )與膽鹽發(fā)生反應，形成膽酸沉淀。培養基可由原來(lái)的綠色變?yōu)辄S色。
陰性 陽(yáng)性
4. 大腸菌群最大可能數（MPN）報告
?確證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數，檢索MPN表，報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
?當實(shí)驗結果在MPN表中無(wú)法查找到MPN值時(shí)，如：陽(yáng)性管數為122，123，232，233等時(shí)，建議增加稀釋度（可做4~5個(gè)稀釋度），使樣品最高稀釋度能達到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度），然后再遵循相關(guān)的規則進(jìn)行查找，最終確定MPN值。
表:大腸菌群最可能數(MPN)檢索表
陽(yáng) 性 管 數 | MPN | 95%可 信 限 | 陽(yáng) 性 管 數 | MPN | 95%可 信 限 | ||||||
0.10 | 0.01 | 0.001 | 下 限 | 上 限 | 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下 限 | 上 限 | ||
0 | 0 | 0 | <3.0 | — | 9.5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4.5 | 42 |
0 | 0 | 1 | 3.0 | 0.15 | 9.6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 0 | 3.0 | 0.15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 1 | 6.1 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8.7 | 94 |
0 | 2 | 0 | 6.2 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8.7 | 94 |
0 | 3 | 0 | 9.4 | 3.6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4.6 | 94 |
1 | 0 | 0 | 3.6 | 0.17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8.7 | 110 |
1 | 0 | 1 | 7.2 | 1.3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
1 | 0 | 2 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
1 | 1 | 0 | 7.4 | 1.3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 75 | 17 | 200 |
1 | 1 | 1 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
1 | 2 | 0 | 11 | 3.6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
1 | 2 | 1 | 15 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
1 | 3 | 0 | 16 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
2 | 0 | 0 | 9.2 | 1.4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
2 | 0 | 1 | 14 | 3.6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1000 |
2 | 0 | 2 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1000 |
2 | 1 | 0 | 15 | 3.7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2000 |
2 | 1 | 1 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1100 | 180 | 4100 |
2 | 1 | 2 | 27 | 8.7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1100 | 420 | — |
注1:本 表 采 用3個(gè) 稀 釋 度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每 個(gè) 稀 釋 度 接 種3管 。 注2:表 內 所 列 檢 樣 量 如 改 用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí),表 內 數 字 應 相 應 降 低10倍;如 改 用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時(shí),則 表 內 數 字 應 相 應 增 高10倍,其 余 類(lèi) 推 。 | |||||||||||
三、GB4789.3-2016大腸菌群計數平板法
1. 大腸菌群平板計數法流程圖
2. 培養基原理解析
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
?配方中膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。
?大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結合，可形成粉紅色菌落菌落周?chē)心懰猁}沉淀環(huán)。
?該培養基無(wú)需高溫高壓滅菌，現配現用。
大腸埃希氏菌ATCC25922在VRBA上的菌落形態(tài)
3. 計數典型和可疑菌落數
結果判讀：選取菌落數在15 CFU～150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm或更大。
證實(shí)試驗：從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10 個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養24 h～48 h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。
4. 大腸菌群平板計數的報告
?經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管,則該樣品的大腸菌群數為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(cháng),則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
?若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(cháng)，則小于1乘以最低稀釋倍數計算。
四、質(zhì)量控制
1. 實(shí)驗室過(guò)程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。
2. 為了控制環(huán)境污染，每次檢驗過(guò)程中，于檢驗臺上打開(kāi)兩塊計數瓊脂平板，并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養，以掌握檢驗過(guò)程中是否存在來(lái)自檢驗環(huán)境的污染。
3. 定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應定量活菌參考品，在P2實(shí)驗室或陽(yáng)性對照實(shí)驗室內，用適當的食品樣品進(jìn)行陽(yáng)性實(shí)驗驗證，并進(jìn)行記錄，次驗證實(shí)驗至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。
五、大腸菌群測試片法
1. 原理：大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐，其上覆蓋干燥培養基層（營(yíng)養物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑）和透明隔水膜組成，經(jīng)輻照滅菌?？捎糜谑称?、飲料等的大腸菌群計數。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。
2. 特點(diǎn)優(yōu)勢
?菌落計數特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開(kāi)，無(wú)菌落重疊現象；
?菌落分布特別均勻；
?避免了培養基對細菌熱損傷有關(guān)；
?菌落蔓延或半透明菌膜現象很少發(fā)生
?經(jīng)濟環(huán)保 無(wú)粉塵，體積小，重量輕，易儲運
?保質(zhì)期長(cháng)干制無(wú)水培養基，性質(zhì)穩定，保質(zhì)期更長(cháng)
六、所需培養基試劑和質(zhì)控菌株
用途 | 貨號 | 名稱(chēng) | 規格 |
樣品稀釋 | CP0630 | 生理鹽水 | 盒（袋裝）225 mL×10袋 |
CP0511A | 磷酸鹽緩沖液（PBS） | 盒（瓶裝）225 mL×6瓶 | |
CP0640 | 磷酸鹽緩沖液（PBS） | 盒（袋裝）225 mL×10袋 | |
022117 | 磷酸鹽緩沖液（PBS） | 瓶（干粉）250 g | |
CP0310 | 生理鹽水 | 盒（管裝）9 mL×20支 | |
MPN法計數初發(fā)酵試驗 | 022210 | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） | 瓶（干粉）250g |
022210P1 | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST) | 瓶（顆粒）250 g | |
022210A | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） | 盒（管裝）10 mL×20支 | |
22210G1 | 雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 | 盒（管裝）10 mL×20支 | |
平板計數 | 022221 | 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） | 瓶（干粉）250g |
022221P1 | 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） | 瓶（顆粒）250g | |
C22221B1 | 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
MPN法復發(fā)酵和平板計數證實(shí) | 022220 | 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） | 瓶（干粉）250g |
022220P1 | 煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB) | 瓶（顆粒）250g | |
022220A | 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） | 盒（管裝）10 mL×20支 | |
HANDYPLAT微生物測試片 | HP002 | 大腸菌群測試片 | 20片/包 |
Q-Strain定量質(zhì)控菌株 | QS011A | 大腸埃希氏（ATCC25922） | 110-1100 CFU/瓶 |
QS011B | 大腸埃希氏菌（ATCC25922） | (0.6-2.0)×107CFU/瓶 |
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